Текущий выпуск

Введение

Вклад в развитие и поддержание иммунного воспаления, патологической аутоиммунной реакции могут вносить общебиологические процессы (апоптоз, нетоз), эпигенетическая регуляция [1—3]. На сегодняшний день существует достаточное количество исследований, которые свидетельствуют об изменениях содержания внеклеточной ДНК (вкДНК) в крови при определенных патологических процессах, а также об использовании этого показателя в качестве диагностического критерия при некоторых заболеваниях [1; 4—7]. Кроме того, в некоторых работах [8; 9] предполагается, что вкД НК животных и человека обладает иммуномодулирующими свойствами и в основе механизма ее действия может лежать связывание с рецепторами распознавания образов, например TLR9 [1]. Белки TLR9 входят в обширное семейство толл-подобных рецепторов (toll-like receptors), естественными лигандами которых являются определенные консервативные участки в молекулах патогенных бактерий и вирусов, объединяемых под названием патоген-ассоциированных молекулярных фрагментов [10]. Благодаря способности распознавать такие фрагменты белки этого семейства играют важную роль в создании первой линии защиты от инфекционных агентов, обеспечивая инициацию реакций врожденного иммунитета и развитие неспецифического воспаления при попадании в организм инфекционных агентов. Параллельно с этим TLR-белки способны активировать механизмы последующего специфического иммунного ответа на конкретные патогены, участвуя тем самым в регуляции направления и интенсивности иммунных реакций [10; 11].

TLR9 экспрессируются главным образом в клетках иммунной системы, таких как B-клетки, дендритные клетки и моноциты / макрофаги, и активируются в ответ на ДНК, содержащую неметилированные CpG-мотивы, которые характерны для бактериальной ДНК, участвуя в регуляции реакций врожденного противоинфекционного иммунитета [11—13]. При определенных условиях TLR9 могут распознавать и ауто-ДНК, в результате чего происходит активации этих рецепторов, инициируется воспаление и увеличивается продукция провоспалительных цитокинов [14]. Благодаря этому TLR9-белки могут принимать участие в развитии аутоиммунных реакций. Было обнаружено, что нокаут гена TLR9 у мышей с иммунокомплексным люпус-подобным нефритом приводит к значительному усилению проявлений болезни, в то время как гиперэкспрессия этого гена в В-клетках заметно тормозит развитие нефрита [15].

Исходя из представленных данных, представлялось актуальным изучить влияние активации TLR9 специфическим агонистом ODN 1826 на изменения уровней вкДНК в крови мышей и продукцию TNF-α в ответ на экзогенный провоспалительный стимул, а также выяснить возможность модуляции экспрессии гена TLR9 в клетках иммунной системы синтетическими лигандами этого рецептора, в том числе вкДНК крови, уровень которой существенно возрастает в ранней фазе воспалительного ответа.

Следует иметь в виду, что иммунная система контролирует развитие и интенсивность воспалительных реакций, так что сдвиг баланса хелперов в сторону Th1-лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины, является постоянным элементом реакций организма на индуцирующие воспаление внешние воздействия [16].

В связи с этим естественно ожидать, что во многих случаях изменение уровня вкДНК в крови может быть значимо связано с величиной Th1/Th2-соотношения в организме, что во многом определяет патогенез воспалительных процессов при различных заболеваниях.

Материалы и методы

Объекты исследования

В качестве экспериментальных животных были выбраны линии мышей C57BL/6 и Balb/c, оппозитных, как известно из данных литературы [17], в отношении ответа на развитие воспаления. В опыты были включены здоровые половозрелые 6—8-недельные мыши, содержавшиеся в виварии в условиях, соответствующих требованиям эксперимента. Животные получали гранулированный комбикорм, сбалансированный по потребностям в белках, жирах, углеводах, витаминах, минеральных веществах и микроэлементах в рациональных дозах (ГОСТ Р 50258-92). Все эксперименты проводили в стандартных условиях содержания животных, соблюдения температурного режима, освещенности. В работе использовали самок мышей линий C57BL/6 и Balb/c (виварий, г. Томск). Экспериментальные исследования выполнены в полном соответствии с требованиями Международной конвенции по гуманному обращению с подопытными животными (Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (г. Страсбург, 1986) и Директивой № 2010/63/ЕС Европейского парламента и совета ЕС о защите животных, использующихся для научных целей (г. Страсбург, 2010). Исследование на экспериментальных животных одобрено локальным этическим комитетом НИИФКИ (протокол № 92 от 10.11.2015).

Мыши каждой из исследуемых линий были разделены на четыре группы (по 6 животных):

1-я — интактные мыши;

2-я — животные с воспалительной реакцией, вызванной введением LPS (контроль);

3-я — мыши, которым помимо LPS был введен специфический лиганд TLR9 — ODN 1826, содержащий в своей структуре два CpG-динуклеотида;

4-я — мыши, которым помимо LPS был введен другой лиганд TLR9 — ODN 1982, где CpG-динуклеотиды отсутствуют.

Всем животным экспериментальных групп (группы 2—4) однократно внутрибрюшинно вводили LPS E. coli штамма 111:B4 (Sigma, США) в дозе 1 мкг/ мышь. Животным, входящим в группу 1, вводился соответствующий объем PBS. Мышам в группах 3 и 4 двукратно до инъекции липополисахарида (LPS) подкожно 2 раза с интервалом в два дня вводили ODN 1826 или в качестве контроля ODN 1982 в дозе 25 мкг/мышь. Через 4 ч после введения LPS мышей забивали, забирали у них кровь для последующих исследований.

Методы исследования

Выделение и количественное определение вкДНК проводили согласно методике [18]. Кровь собирали в пробирки, содержащие 3 × PBS (PBS — 10 мМ фосфатный буфер рH 7,4, 0,15 М NaCl) и 15 mМ ЭДТА в качестве антикоагулянта. Плазму отделяли центрифугированием при 400 g в течение 20 мин. К осажденным клеткам добавляли девятикратный объем PBS с 5 mM ЭДТА, супернатант отделяли центрифугированием при 400 g в течение 20 мин. Для определения вкДНК, связанной с клеточной поверхностью, клетки инкубировали 5 мин с 0,25%-ным раствором трипсина, реакцию останавливали добавлением ингибитора трипсина из соевых бобов (Sigma, США) и центрифугированием отделяли супернатант, содержащий вкДНК. Выделение ДНК из полученных фракций проводили на колонках компании «БиоСилика» (Новосибирск) согласно прилагаемой инструкции. Определение ДНК осуществляли с помощью флюоресцентного красителя PicoGreen (Invitrogen, США). ДНК рассчитывалась по калибровочной кривой, построенной для известных концентраций стандартной двухцепочечной λ ДНК.

Количество TNFα в сыворотке крови мышей определяли иммуноферментным методом с помощью набора Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA kit (R&D Systems, Inc, США).

Определение количества мРНК гена TLR9 осуществлялось методом ПЦР в режиме «реального времени» на приборе CFX96 Thermal Cycler (Bio-Rad, США).

Статистическая обработка

Результаты в таблицах и на рисунках приведены в виде средних величин. Достоверность выявленных различий и величину связей между измеренными параметрами оценивали методом непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна — Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при достигнутом уровне p < 0,05.

Результаты и обсуждения

Оценка влияния синтетических лигандов TLR9 на развитие воспалительной реакции у мышей линий C57BL/6 и Balb/c

В задачу исследования входила оценка уровня вкДНК и продукции TNFα у интактных и LPS-стимулированных экспериментальных животных и изучение влияние олигонуклеотида ODN 1826 (агониста TLR9) на уровень вкДНК и синтез TNFα у мышей линий C57BL/6 и Balb/c.

В ранее проведенных исследованиях [19—21] нами было обнаружено, что концентрация вкДНК в плазме крови существенно увеличивается при ответе на небольшую дозу LPS и, следовательно, этот параметр может служить одним из показателей интенсивности воспалительных процессов в организме. Такой хорошо согласующийся с имеющимися литературными данными вывод был сделан нами на основании результатов экспериментов, проведенных на других линиях мышей. Результаты настоящего исследования на мышах C57BL/6 и Balb/c свидетельствуют, что повышение уровней вкДНК в плазме крови на ранней стадии развития воспалительных реакций наблюдается у животных этих линий (графа 1 в таблицах 1 и 2). Этот показатель хорошо коррелировал с повышением уровня TNF-a в ответ на воспалительный стимул как у мышей C57BL/6 (р = 0,51, р < 0,05), так и у Balb/c (р = 0,44, р < 0,05).

Таблица 1

Влияние лигандов рецептора TLR9 на показатели LPS-стимулированного
воспалительного ответа у мышей линии C57BL/6

Table 1

The effect of TLR9 receptor ligands on LPS-stimulated inflammatory response in C57BL/6 mice

Примечание. Обозначения фракций вкДНК в столбце «Внеклеточная ДНК»: 1 — плазма; 2 — буфер; 3 — вкДНК, связанная с поверхностью клеток; N/L — соотношение «нейтрофилы / лимфоциты» в крови.

Достоверное отличие от группы 1 (контроль): * — р < 0,05; ** — р < 0,01.

Достоверное отличие от группы 2 (+LPS): # — р < 0,05; ## — р < 0,01.

Note: Designations of cfDNA fractions in the “Cell-Free DNA” column: 1 — plasma; 2 — buffer; 3 — cell-surface-bound cfDNA; N/L — neutrophil / lymphocyte ratio in the blood.

Significant difference from group 1 (control): * — p < 0.05; ** — p < 0.01.

Significant difference from group 2 (+LPS): # — p < 0.05; ## — p < 0.01.

Другим значимым следствием развития в организме животных воспалительной реакции можно считать снижение количества вкДНК, ковалентно связанной с белками на поверхности клеток крови, и, соответственно, уменьшение соотношения «вкД НК, связанная с поверхностью клеток / суммарная вкДНК», что видно из результатов, представленных в таблицах 1, 2. При этом у линии Balb/c эти изменения достоверны (табл. 2).

Таблица 2

Влияние лигандов рецептора TLR9 на показатели LPS-стимулированного воспалительного ответа у мышей линии Balb/c

Table 2

The effect of TLR9 receptor ligands on LPS-stimulated inflammatory response
in Balb/c mice

Примечание. Обозначения фракций вкДНК в столбце «Внеклеточная ДНК»: 1 — плазма; 2 — буфер; 3 — вкДНК, связанная с поверхностью клеток; N/L — соотношение «нейтрофилы / лимфоциты» в крови.

Достоверное отличие от группы 1 (контроль): * — р < 0,05; ** — р < 0,01.

Достоверное отличие от группы 2 (+ LPS): # — р < 0,05; ## — р < 0,01.

Note: Designations of cfDNA fractions in the “Cell-Free DNA” column: 1 — plasma; 2 — buffer; 3 — cell-surface-bound cfDNA; N/L — neutrophil/lymphocyte ratio in the blood.

Significant difference from group 1 (control): * — p < 0.05; ** — p < 0.01.

Significant difference from group 2 (+ LPS): # — p < 0.05; ## — p < 0.01.

В данной работе было исследовано влияние на вышеуказанные параметры двух лигандов TLR9: олигонуклеотида ODN 1826, содержащего в своей структуре два CpG-динуклеотида, что должно обеспечивать выраженную активацию TLR9, и олигонуклеотида ODN 1982, в котором CpG-динуклеотиды отсутствуют. Оба использованных препарата представляли собой фосфотиоатные производные соответствующих олигонуклеотидов, что обеспечивает их устойчивость к разрушению эндогенными нуклеазами [22].

Из приведенных в таблицах 1, 2 данных видно, что ODN 1826 — агонист TLR9 — существенно увеличивает интенсивность воспалительного ответа на LPS, оцениваемую с помощью исследованных нами параметров (уровни TNF-a и вкДНК в плазме, уровень связанной с поверхностью клеток вкДНК и отношение связанной с поверхностью клеток вкДНК к суммарной вкДНК). Это согласуется с имеющимися литературными данными и может быть истолковано, как способность активированного TLR9 влиять на Th1/Th2-соотношение, сдвигая этот баланс в провоспалительную сторону. Из работ других авторов известно, что агонисты этого рецептора могут стимулировать продукцию IL-12 дендритными клетками [23] и подавлять Th2-зависимые иммунные реакции при аллергии [24] и аутоиммунных процессах [10; 25].

Не содержащий CpG олигонуклеотид (ODN 1982) не воздействовал на показатели воспалительной реакции, такие как уровень TNF-a и количество вкДНК в плазме у мышей обеих линий. Однако фракция вкДНК, связанной с поверхностью клеток, значительно снижена, что приводит к изменению индекса, то есть соотношения этой фракции к общему количеству вкДНК, что может косвенно свидетельствовать о том, что не только фрагменты ДНК, богатые неметилированными CpG-динуклеотидами, могут быть лигандами TLR9. При этом нельзя исключать и другие потенциальные механизмы активации или блокировки данного рецептора, что, конечно, требует дополнительных исследований.

Выявленные нами изменения параметров воспалительного ответа у мышей исследованных линий не позволяют охарактеризовать мышей Balb/c как генетически предрасположенных к иному варианту ответа на воспалительные стимулы, нежели наблюдаемый у мышей линии C57BL/6. Следует отметить, что у мышей Balb/c, даже у интактных животных, уровни TNF-α и вкДНК в плазме почти в два раза выше, чем у мышей C57BL/6 (табл. 1, 2), тогда как на фоне воспалительной реакции и под действием ODN 1826 эти показатели в группах 2 и 3 у линии Balb/c выше в 3—4 раза, чем у C57BL/6. Можно предположить, что различия ответа на активацию TLR9 проявляются в силе реакции, а не в разнонаправленности эффектов. В обеих линиях наблюдается значительное снижение содержания вкДНК, ковалентно связанной с белками на поверхности клеток, и, соответственно, уменьшение соотношения «вкДНК, связанная с поверхностью клеток / суммарная вкДНК», что видно из результатов соотношения «трипсин / суммарная вкДНК» (табл. 1, 2).

В качественном отношении выявленные изменения оцениваемых параметров сходны у обеих линий мышей, то есть различия ответа на активацию TLR9 проявляются не в разнонаправленности действия, как предполагалось изначально, а в выраженности реакции.

Этот вывод формально противоречит известной оппозитности указанных линий в отношении иммунного ответа на Т-зависимые антигены (у Balb/c выше Th2- зависимый гуморальный ответ, в то время как у C57BL/6 выше Th1-зависимая реакция ГЗТ) и результатам недавней работы группы китайских авторов [17]. В их исследовании было установлено, что при развитии воспалительного процесса концентрация вкДНК в плазме крови мышей Balb/c, измеряемая в течение нескольких дней после заражения животных, заметно ниже, чем у C57BL/6 при аналогичных условиях эксперимента. В нашей работе такое отличие не наблюдалось и даже интенсивность ответа на LPS у Balb/c была несколько выше, чем у C57BL/6. Однако на деле между полученными нами и литературными данными нет реального противоречия, поскольку, во-первых, в цитируемой работе речь идет о тяжелом септическом процессе с гибелью почти всех экспериментальных животных, в то время как в ранее выполненных нами экспериментах вызванное LPS-воспаление имело умеренную интенсивность с возвращением всех показателей к исходному уровню через 24 ч после введения липополисахарида [20]. Во-вторых, и это главное, как было показано в исследовании китайских авторов, в первые сутки после заражения постепенное увеличение концентрации вкДНК в крови происходит совершенно одинаково у обеих исследованных линий мышей [17], что полностью совпадает с результатами нашей работы.

Следует предполагать, что величина и направление конкретных изменений в организме этих животных при дальнейшем развитии воспаления обусловлены совокупным действием многих регуляторных факторов, одним из которых может быть степень экспрессии TLR9 у мышей различных линий и его активации при различных воздействиях.

Результаты проведенных экспериментов и данные литературы дают основание предполагать, что способные активировать TLR9 препараты бактериальной ДНК и синтетические лиганды этого рецептора (со свойствами как его агонистов, так и антагонистов) могут оказаться эффективными фармакологическими средствами при лечении иммунопатологических процессов, при которых требуется коррекция Th1/Th2-баланса. Выяснение их терапевтических возможностей представляется актуальной задачей дальнейших исследований.

Оценка экспрессии гена TLR9 у мышей различных линий при воздействии синтетических лигандов этого рецептора

После изучения эффектов синтетических лигандов TLR9 на развитие воспаления в экспериментальной модели и выяснения того факта, что уровни вкДНК и TNFa в крови мышей — как C57BL/6 (Th1), так и Balb/c (Th2) — существенно зависят от воздействия на TLR9, было исследовано влияние этих лигандов на экспрессию гена TLR9 (количество мРНК TLR9) и сделана попытка выявить взаимосвязь этого процесса с уровнем вкДНК при разных типах иммунологического ответа Th1 и Th2 у мышей линии C57BL/6 и Balb/c.

Данные, полученные в экспериментах, в которых изучалось возможное влияние лигандов TLR9 на экспрессию гена TLR9 в спленоцитах мышей двух оппозитных линий, представлены в таблице 3.

Таблица 3

Изменения уровней мРНК гена TLR9 в спленоцитах мышей линий Balb/c
и C57BL/6 под влиянием LPS и лигандов данного рецептора

Table 3

Changes in TLR9 mRNA levels in splenocytes of Balb/c and C57BL/6 mice under
the influence of LPS and ligands of this receptor

Примечание: %↑↓ — относительно контрольных групп соответствующих линий мышей.

Note: %↑↓ — relative to the control groups of the corresponding mouse strains.

Отличия между исследованными группами, которые представлены в таблице 3, не позволяют считать, что использованные нами искусственные лиганды могут существенно влиять на транскрипцию мРНК TLR9 в иммунокомпетентных клетках (спленоцитах), так как изменения недостоверны. То же можно сказать и о соответствующем влиянии вкДНК на этот параметр (по крайней мере в ранней фазе воспалительного ответа на введение LPS, когда уровень вкДНК в крови существенно возрастает).

Следовательно, наблюдаемые эффекты лигандов TLR9 на развитие воспалительной реакции нельзя объяснить изменениями количества мРНК этого рецептора, а, видимо, можно связать с активацией уже существующих TLR9. Этот факт, разумеется, не исключает возможности влияния лигандов данного рецептора (в том числе и вкДНК крови) на его экспрессию в более поздние периоды после их воздействия. Однако проверка такого предположения требует проведения специальных экспериментов.

Заключение

В экспериментах на мышах линий Balb/c и C57BL/6 продемонстрирована возможность модулирования воспалительной реакции в ответ на LPS с использованием синтетических лигандов рецептора TLR9. Введение агониста TLR9 — ODN 1826 — увеличивало у мышей показатели интенсивности воспаления при введении LPS, характеризующиеся повышением концентрации TNFα и вкДНК в крови животных и уменьшением содержания вкДНК, ковалентно связанной с белками на поверхности клеток. Не содержащий CpG олигонуклеотид ODN 1982 в меньшей степени воздействовал на показатели воспалительной реакции. На раннем этапе развития воспаления реакция мышей Balb/c на LPS качественно не отличалась от аналогичной реакции у мышей линии C57BL/6. Результаты проведенных экспериментов и данные литературы дают основание предполагать, что способные активировать TLR9 препараты бактериальной ДНК и синтетические лиганды этого рецептора (со свойствами как его агонистов, так и антагонистов) могут оказаться эффективными фармакологическими средствами при лечении иммунопатологических процессов, при которых требуется коррекция Th1/Th2-баланса. Исследование их терапевтических возможностей представляется актуальным и перспективным направлением.

В то же время обнаружено, что лиганды TLR9 (как синтетические лиганды, так и вкД НК плазмы крови, уровень которой существенно возрастает после стимуляции острой воспалительной реакции у этих животных) не приводят к достоверным изменениям экспрессии гена TLR9 в спленоцитах мышей, по крайней мере в ранней фазе воспалительного ответа на введение LPS. Однако не исключается возможность влияния лигандов данного рецептора (в том числе и вкДНК крови) на экспрессию гена TLR9 в более поздние периоды после их воздействия.