Текущий выпуск

Введение

Долгое время считалось, что жировая ткань выполняет лишь депонирующую функцию, в частности выступает в качестве резервного источника субстратов для энергетического обмена. В настоящее время доказано, что адипоциты обладают высокой секреторной активностью, а белая жировая ткань, являясь источником гормоноподобных веществ, реализует свои системные эффекты и значимо влияет на патогенез сердечно-сосудистых, неврологических, эндокринных и других заболеваний [1—3].

Хронический субклинический воспалительный процесс в висцеральной жировой ткани при ее избыточном накоплении является одним из патогенетических факторов метаболического синдрома (МС) — комплекса гормональных и метаболических нарушений у больных с атеросклерозом, гипертонией, ожирением и сахарным диабетом 2-го типа [4; 5].

Секреторный профиль адипоцитов характеризуется широким спектром биологически активных молекул с про- и противовоспалительными свойствами. К ним относятся пептидные гормоны (лептин, адипонектин, апелин, резистин, оментин, васпин, компоненты ренин-ангиотензиновой системы и др.), вазоактивные вещества (простагландины, лейкотриены и др.), хемокины и цитокины [6—8].

Эффекты большинства адипоцитокинов хорошо изучены, однако роль отдельных молекул, секретируемых жировой тканью, в патогенезе воспаления при МС и связанных с ним патологий окончательно не выяснена и часто трактуется специалистами неоднозначно. Например, общепринятым является представление об адипонектине как о гормоне с антиатерогенными, противовоспалительными и инсулинсенситизирующими свойствами [9]. В последние годы в научной литературе обсуждается феномен под названием «адипонектиновый парадокс», демонстрирующий неканонические провоспалительные эффекты адипонектина [10; 11]. В ряде исследований была обнаружена положительная взаимосвязь высокой сывороточной концентрации адипонектина с частотой неблагоприятных исходов у больных с хронической сердечной недостаточностью, развитием воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, сахарный диабет 1-го типа, хроническая обструктивная болезнь легких и др., а также некоторых видов рака [12—14].

Таким образом, сведения о физиологической и патологической роли адипокинов пополняются, однако механизмы реализации их плейотропных эффектов до конца не изучены [9]. На наш взгляд, это связано с особенностями методических подходов к оценке секреторного потенциала клеточных элементов жировой ткани, поскольку в большинстве исследований их секреция исследуется по уровню концентрации анализируемых веществ в крови [14; 15]. Такой подход не позволяет в полной мере охарактеризовать секреторную активность непосредственно адипоцитов, поскольку сходный спектр, например интерлейкинов, характерен для клеток иммунной системы, эндотелиоцитов, фибробластов и др. [4]. Кроме того, при исследовании патогенетических факторов такого сложного симптомокомплекса, как МС, необходимо учитывать еще и такие аспекты, как коморбидный фон пациента, глубина нарушений обмена веществ (углеводного: уровень глюкозы, инсулина, индекс инсулинорезистентности (HOMA-IR); липидного: уровень общего холестерола, липопротеинов низкой плотности, триацилглицеролов), а также степень выраженности субклинического хронического воспаления, например по уровню белков острой фазы в крови: С-реактивного белка, неоптерина, фибриногена и др. [16].

Анализируя плейотропные эффекты адипокинов, также следует принимать во внимание локализацию экспрессирующих их адипоцитов [17]. Например, при абдоминальном — метаболически неблагополучном — варианте ожирения выраженная гипертрофия адипоцитов сопровождается накоплением в жировой ткани иммунных клеток (макрофагов и лимфоцитов), функциональная, в том числе секреторная, активность которых может значимо влиять на спектр продуцируемых адипоцитарных гомонов и других биологически активных веществ [18—20].

Цель исследования

Цель исследования — оценить экспрессию генов адипоцитокинов в биоптатах висцеральной жировой ткани у лиц с метаболическим синдромом.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 19 человек в возрасте от 26 до 70 лет (19 женщин), распределенных на 2 группы: в основную группу вошли пациенты с МС (всего 14 женщин, средний возраст — 45,7 ± 4,1 лет, индекс массы тела (ИМТ) 38,1 ± 2,4 кг/м2), в группу сравнения — пациенты без признаков МС (5 женщин), средний возраст — 38,6 ± 5,5 лет, ИМТ 23,5 ± 4,3 кг/м2). Диагностика составляющих МС проводилась в соответствии с рекомендациями Консенсуса Российского кардиологического общества и Российского научного медицинского общества терапевтов по критериям (на 2025 г.) при обнаружении трех показателей: одного основного и двух дополнительных. Основной критерий — абдоминальное ожирение, при котором окружность талии составляет > 80 см у женщин. Дополнительные критерии: артериальная гипертензия (артериальное давление ≥ 130/80 мм рт. ст. или прием гипотензивных препаратов), повышение концентрации холестерола липопротеидов низкой плотности (> 3,0 ммоль/л), снижение концентрации холестерола липопротеидов высокой плотности (< 1,2 ммоль/л), повышение уровня триацилглицеролов (≥ 1,7 ммоль/л), гипергликемия натощак (концентрация глюкозы в плазме крови натощак ≥ 6,1 ммоль/л), нарушение толерантности к глюкозе (концентрация глюкозы в плазме крови через 2 ч после нагрузки глюкозой в пределах ≥ 7,8 и < 11,1 ммоль/л).

Все обследованные лица были госпитализированы в хирургический стационар для проведения плановой холецистэктомии по медицинским показаниям (желчнокаменная болезнь (ЖКБ)). Исследование было утверждено на заседании локального этического комитета СибГМУ (рег. № 2862 от 28.11.2011). Критерии исключения: наличие активного воспалительного процесса в желчном пузыре; присутствие осложнений ЖКБ и воспалительных процессов другой локализации, развитие злокачественных новообразований, системных заболеваний соединительной ткани, прием гормональных препаратов. Все пациенты, участвовавшие в исследовании, подписали информированное согласие.

Материалом для исследования были биоптаты висцеральной жировой ткани из большого сальника, которые получали в ходе эндоскопической операции. Биоптаты висцеральной жировой ткани в объеме 1 см3 замораживали при – 70 °С в растворе для стабилизации РНК и хранения образцов (RNA-later, Thermo FS, США). Оценку уровня экспрессии мРНК адипоцитокинов клетками висцеральной жировой ткани проводили с применением количественной ПЦР в реальном времени. Из образцов жировой ткани выделяли общую РНК с помощью набора «Qiagen RNeasy Mini Kit Lipid Tissue» («QIAGEN», США). Оценку качества тотальной РНК определяли электрофоретическим методом по соотношению плотности бэндов, равноценных большой (28S) и малой (18S) рибосомным субъединицам рРНК.

В реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, M-MLV RT) («Медиген», Россия) нарабатывали комплементарную ДНК. Далее осуществляли постановку ПЦР в реальном времени с использованием прямого и обратного праймеров для генов адипоцитокинов («Биосинтез», Россия):

— ИЛ-1β (ген IL1B: for 5’-ATG-GAC-AAG-CTG-AGG-AAG-ATG-3’;

— rev 5’-CCC-ATG-TGT-CGA-AGA-AGA-TAG-G-3’);

— ИЛ-6 (ген IL6: for 5’-GAC-AGC-CAC-TCA-CCT-CTT-C-3’;

— rev 5’-GTG-CCT-CTT-TGC-TGC-TTT-C-3’);

— ИЛ-8 (ген IL8: for 5’-GGA-CAA-GAG-CCA-GGA-AGA-AA-3’;

— rev 5’-GGG-TGG-AAA-GGT-TTG-GAG-TAT-3’);

— TNF-α (ген TNF-α: for 5’-CAG-GCA-GTC-AGA-TCA-TCT-TCT-C-3’;

— rev 5’-CTG-GTT-ATC-TCT-CAG-CTC-CAC-3’);

— адипонектин (ген ADIPOQ: for 5’-CAT-CTC-CTC-CTC-ACT-TCC-ATT-C-3’;

— rev 5’-GTC-GTG-GTT-TCC-TGG-TCA-T-3’);

— лептин (ген LEP: for 5’-AAG-CTG-TGC-CCA-TCC-AAA-3’;

— rev 5’-GTC-CAA-ACC-GGT-GAC-TTT-CT-3’);

— резистин (ген RETN: for 5’-AAT-GAG-AGG-ATC-CAG-GAG-GT-3’;

— rev 5’-CTG-GCA-GTG-ACA-TGT-GGT-3’);

— висфатин (ген NAMPT: for 5’-GTG-GAG-GTT-TGC-TAC-AGA-AGT-3’;

— rev 5’-TGG-GTC-CTT-GAA-GAC-GTT-AAT-C-3’).

ПЦР проводили в детектирующем термоциклере (MiniOpticon «Biorad», США). В качестве нормировочного гена использовали β-actin (бета-актин) (for 5’-CTG-GCA-CCC-AGC-ACA-ATG-3’; rev 5’-AGC-GAG-GCC-AGG-ATG-GA-3’). Количество ДНК в пробах было представлено в виде процентов от количества бета-актина (сравнительный Сt- метод). При анализе результатов ПЦР в реальном времени оперировали абсолютными значениями концентраций (копий на мл), полученными по прибору. Производили расчет средних значений для дублей по бета-актину в отдельности для каждого образца ДНК. Вслед за этим значения концентраций по каждому гену для данного образца делили на среднее значение для дублей по бета-актину для этого образца. По полученным процентным значениям рассчитывали средние для дублей и использовали эти показатели в последующих исследованиях (усл. ед.) [21].

Результатом циклического процесса ПЦР является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой А = М · 2n, где А — количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации после завершения цикла n; М — начальное количество ДНК-мишеней; n — число циклов амплификации; 2 — коэффициент эффективности реакции ПЦР (эффективность ПЦР). Реальное значение эффективности отдельных циклов амплификации может быть, по некоторым данным, от 78 до 97 %. Если в пробе присутствуют ингибиторы реакции, то имеющиеся значение могут быть намного меньше, поэтому фактическое количество специфических продуктов амплификации описывали по формуле А (n) = М · (1 + Е)n, 0 < E < 1, где Е — значение эффективности реакции. В процессе амплификации на исходной цепи синтезируются также и длинные фрагменты, но их накопление происходит в арифметической прогрессии по формуле К (n) = M · n, где K (n) — количество длинных продуктов амплификации (фрагментов), полученных после цикла n [22; 23].

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез. Статистическую обработку полученных результатов проводили путем создания единой электронной базы данных с использованием пакета «Microsoft Office Access 2016» и последующей обработкой полученных результатов с использованием пакета программ STATISTICA 10.0 (StatSoft, Inc., USA). Количественные данные, не подчиняющиеся нормальному закону, представляли в виде медианы, интерквартильного размаха 25-го и 75-го процентилей — Ме (LQ; UQ). Проверку нормальности распределения проводили методом Шапиро — Уилка и представляли в виде среднего и стандартного отклонения (M ± SD). При отсутствии нормального распределения при сравнении средних групповых количественных признаков применяли тест Манна — Уитни (U-тест) или t-критерия Стьюдента. Различие двух сравниваемых величин полагали достоверным при уровне значимости р < 0,05. Качественные признаки были представлены в виде n, % (число больных с данным признаком, % от их количества в группе). Для оценки статистической взаимосвязи между показателями вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r). Для анализа связи между независимыми переменными и зависимой переменной использовали логистический регрессионный анализ (с целью приведения распределения к нормальному, применяли логарифмическое преобразование данных), определяя коэффициент корреляции (R).

Результаты

Способность синтезировать и секретировать большое количество медиаторов, включая цитокины, хемокины, белки внеклеточного матрикса, гормоны, факторы роста и вазоактивные вещества, определяет функциональный плейотропизм висцеральной жировой ткани и ее системное влияние на различные физиологические и патологические процессы в организме [24; 25].

Доказано, что воспаление жировой ткани представляет важный компонент МС [4; 5]. Морфологическую основу такого воспаления составляют как гипертрофированные адипоциты, так и иммунокомпетентные клетки: лейкоциты — нейтрофильные гранулоциты, лимфоциты, макрофаги с провоспалительным фенотипом (М1), инфильтрирующие жировую ткань [26; 27].

В ходе проведенного исследования было выявлено, что экспрессия генов провоспалительных цитокинов и пептидных гормонов происходит в висцеральной жировой ткани как у пациентов с МС, так и у лиц без проявлений МС (табл. 1). Статистически значимых различий по уровню мРНК IL-1B, -6, -8, TNF-α, а также гормонов LEP, NAMPT, RETN в жировой ткани у пациентов с МС и лиц группы сравнения выявлено не было.

Таблица 1

Уровень экспрессии мРНК адипоцитокинов в жировой ткани большого сальника
у пациентов с метаболическим синдромом, Me (LQ; UQ)

Table 1

The level of adipocytokine mRNA expression in the adipose tissue of the greater omentum
in patients with metabolic syndrome, Me (LQ; UQ)

Примечание: р — статистическая значимость межгрупповых различий.

Note: p — statistical significance of intergroup differences.

Статистически значимые различия были обнаружены только по уровню экспрессии гена ADIPOQ. Так, в группе пациентов с МС уровень экспрессии гена ADIPOQ в жировой ткани оказался в среднем в 2,8 раза ниже, чем в группе сравнения (р < 0,05).

Обсуждение

Ряд научно-исследовательских работ свидетельствует о том, что в отличие от других адипоцитокинов уровень продукции адипонектина в висцеральной жировой ткани при МС и ожирении и его концентрация в крови снижаются [28—31].

Установлено, что только в зрелых клетках висцеральной жировой ткани (адипоцитах) осуществляется экспрессия гена ADIPOQ. При этом реализуется аутокринный эффект адипонектина — дифференцировка адипоцитов развивается быстрее [29; 31]. Следовательно, снижение продукции адипонектина при ожирении носит компенсаторный характер и составляет часть механизмов, ориентированных на ограничение роста жировой ткани [32]. Помимо этого адипонектин способен оказывать влияние на метаболические процессы за счет цитокиноподобного действия. Так, в эксперименте на мышах — моделях ожирения было продемонстрировано, что гиперэкспрессия гена адипонектина вызывала снижение инфильтрации жировой ткани мононуклеарными лейкоцитами и стимулировала угнетение секреции провоспалительных цитокинов [33; 34]. Таким образом, снижение экспрессии гена ADIPOQ при метаболическом синдроме можно рассматривать как один из патогенетических факторов, способствующих развитию метаболического воспалительного процесса в жировой ткани.

Согласно литературным источникам, некоторые цитокины, такие как ИЛ-6, TNF-α, тормозят экспрессию гена адипонектина [35—37]. Мы не выявили изменений в экспрессии генов биоптатов жировой ткани в отношении провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, -6, -8, TNF-α), вероятно, ввиду методологических ограничений исследования. Был проведен анализ мРНК — начальный этап экспрессии генов [38], а также использованы образцы висцеральной жировой ткани только одной локализации (большой сальник) и малый объем выборки (19 человек). Однако наши результаты в отношении экспрессии генов ADIPOQ, IL-6 и TNF-α в жировой ткани большого сальника согласуются с данными, полученными L. Litvinova et al. [39]. Авторы исследовали особенности экспрессионной активности жировой ткани различной локализации у пациентов с МС и при сравнении экспрессии генов адипокинов в жировой ткани большого сальника, брыжейки и подкожного жирового депо зарегистрировали повышенный уровень экспрессии генов IL6 и TNF-α только в брыжеечной жировой ткани.

В работе М. А. Василенко отмечено, что непосредственно функциональная активность жировой ткани брыжейки тонкого кишечника (а не подкожной жировой ткани или большого сальника) играет значимую роль в патогенезе инсулинорезистентности при ожирении, что доказано повышенным уровнем экспрессии в биоптатах генов LEP, SERPINA12, RARRES2, IL6 и TNF-α, кодирующих соответственно лептин, васпин, химерин, ИЛ-6 и TNF-α [40]. Эти данные соответствуют современным представлениям о функциональной гетерогенности различных жировых депо [41; 42].

Заключение

В результате сравнительного анализа экспрессии генов адипоцитокинов нами было установлено снижение более чем в 2,5 раза экспрессии гена ADIPOQ в жировой ткани большого сальника у пациентов с метаболическим синдромом при сопоставимых с контрольными значениями уровнях экспрессии генов, кодирующих провоспалительные цитокины (ИЛ-1β, -6, -8, TNF-α), лептин, висфатин и резистин. Особенности клеточного состава жировой ткани (адипоциты, стромальные клетки, макрофаги, лимфоциты, гранулоциты) и широкий спектр секретируемых биологически активных веществ (компоненты экстрацеллюлярного матрикса, гормоны, цитокины, хемокины, вазоактивные вещества) определяют необходимость использования дифференциальных подходов к анализу метаболической и функциональной активности жировой ткани разной локализации. Анализ профилей экспрессии генов ключевых адипоцитокинов, функциональных и метаболических особенностей висцеральной жировой ткани представляется перспективным для поиска диагностических и прогностических и маркеров метаболического синдрома и сопряженных с ним патологий.